氮调控下的MAPK级联与植物病原真菌毒力生长：维管束枯萎病为例

植物病原真菌的毒力受多种细胞途径调控，其中已经确定氮限制是触发毒力基因表达的关键信号，而致病性丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联则是在广泛的病原体中作为植物感染所必需的因素。

基于以上条件，本文将研究氮信号与MAPK级联在控制维管束枯萎病真菌感染性生长中的关系，考虑以铵作为首选氮源的条件下，多种MAPK激活的毒力功能是否会受到抑制，并寻找能够抑制植物病原真菌感染性生长的方案。

铵能够抑制两种病原体的侵入性生长，即稻瘟病菌Magnaportheoryzae和小麦赤霉病病原体禾谷镰刀菌，双方间存在一个保守的氮响应通路，该通路通过TOR和MeaB控制植物病原真菌的感染性生长。

真菌病原体使用一系列毒力机制来入侵宿主，克服它们的防御并在它们的组织中定殖，越来越多的证据表明，这些与感染相关的过程受到复杂的细胞通路网络的严格控制，这些细胞通路对来自宿主环境的信号组合作出反应。

有人提出氮限制会触发植物病原体中毒力基因的表达，植物上的真菌感染需要与酿酒酵母的丝状生长级联同源的保守致病性MAPK级联，在维管束枯萎病真菌中，一种土壤传播的病原体，攻击范围广泛的重要经济作物。

穿透玻璃纸膜的能力定义了一个主要的毒力功能，需要Fmk1MAPK及其下游组件，即同源域转录因子Ste12，我们注意到玻璃纸渗透受到氮源的显著影响：在硝酸钠存在的情况下侵入玻璃纸膜，但在硝酸铵、硫酸铵或酒石酸铵上则不会。

氮源铵的抑制作用在另外两种植物病原体中是保守的，即稻瘟病菌和小麦赤霉病病原体，表明氮对侵入性生长的调节可能在许多真菌性植物病原体中发挥作用。

除铵外，Gln是经过测试的不同氨基酸中唯一一种至少部分抑制玻璃纸渗透的氨基酸，与这一发现一致，MSX一种Gln合成酶的不可逆抑制剂在铵存在的情况下完全恢复尖孢镰刀菌的侵入性生长。

Gln合成酶活性对氮抑制的要求表明Gln而不是铵可能充当抑制信号，在酿酒酵母中，Gln水平调节TOR的活性，TOR是一种保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，可协调细胞生长以响应营养物质。

雷帕霉素是一种高度特异性的TOR抑制剂，在存在抑制浓度的铵的情况下也能恢复玻璃纸的渗透，这一结果直接表明TOR与氮信号的传输有关，除了玻璃纸入侵外，铵还以TOR依赖性方式抑制需要Fmk1MAPK级联的其他毒力相关功能。

ΔmeaB菌株能够在存在抑制浓度的铵的情况下进行玻璃纸侵入、营养菌丝融合和根部粘附，通过添加雷帕霉素进一步增强了ΔmeaB突变体的侵入性生长，表明MeaB和TOR都以独立和相加的方式促进铵抑制。

与用硝酸盐供给的植物相比，用野生型菌株的分生孢子接种根并供给铵溶液的幼苗表现出枯萎症状发展的显着延迟，在感染了ΔmeaB菌株的植物中没有检测到氮源对疾病症状严重程度的不同影响。

以上结果强调了氮源在调节植物真菌毒力方面的新作用，但也提出了一些需要在未来研究中解决的问题，氮抑制信号的传输需要来自蛋白激酶TOR和bZIP蛋白MeaB的独立输入，这两种成分以前与植物的真菌致病性无关。

尖孢镰刀菌中受氮控制影响的毒力功能共有的一个共同特征是它们都需要Fmk1MAPK级联，酿酒酵母的丝状形成和侵入性生长反应也受到高浓度铵的抑制并需要直系同源MAPKKss1。

一个核心问题是保守的氮反应和MAPK途径如何相互作用以控制共同的毒力目标，通过结合药理学和遗传学方法，我们发现雷帕霉素处理和meaB缺失都不能恢复Δfmk1菌株的侵入性生长。

这些结果将氮抑制途径置于Fmk1MAPK级联独立或上游，也有证据表明这两条途径之间存在直接联系，先前的研究表明，同源域转录因子Ste12在调节致病性MAPK下游的侵入性生长和植物致病性方面发挥着关键作用。

与硝酸盐相比，铵盐对Ste12转录物水平的强烈下调表明Ste12表达受氮源控制，中Ste12的转录抑制需要MeaB和Area，这与ΔmeaB和ΔareA突变逆转毒力功能氮抑制的表型效应一致。

我们给之前发现的尖孢镰刀菌穿过玻璃纸膜的能力定义了一个主要的毒力功能，需要Fmk1MAPK级联，为了研究氮调节在此过程中的作用，我们确定了野生型菌株，在补充了不同氮源的基本培养基上的玻璃纸渗透能力。

在硝酸钠存在下检测到有效渗透，但在硝酸铵、硫酸铵或酒石酸铵存在下未检测到，表明首选氮源铵的抑制作用，硝酸盐的渗透在很大程度上与碳源无关，因为它同时发生在甘油和浓度高达5%(w/v)的首选碳源葡萄糖上。

利用测试玻璃纸在两种子囊菌病原体中的渗透性，来研究铵的抑制作用是否在其他植物病原真菌中起作用，这两种子囊菌病原体在寄主范围和感染方式上与尖孢镰刀菌不同。

赤霉病病原体禾谷镰刀菌感染正在发育的小麦和大麦的穗状花序，而稻瘟病菌通过特殊的圆顶状附着孔，分离株PH-1和当在硝酸钠上生长时，分离的Guy-11都能够穿过玻璃纸膜，。

在作为氮源测试的不同氨基酸中，只有Gln部分抑制玻璃纸渗透Gln的抑制效果不如铵，这可能是由于这种氨基酸固有的不稳定性或摄取效率低下，我们使用了MSX，一种不可逆且高度特异性的Gln合成酶抑制剂。

酿酒酵母中，细胞内Gln水平调节保守蛋白激酶TOR的活性与具有两种TOR蛋白的酿酒酵母相比，在丝状子囊菌中仅鉴定出一个TOR直系同源物，如构巢曲霉、和腐生丝状真菌Podosporaanserina。

镰刀菌比较基因组数据库的BLASTp分析检测到尖孢镰刀菌中的两个TOR基因同系物，FOXG_02818和FOXG_15946，与密切相关的禾谷镰刀菌和禾谷镰刀菌中的单个同系物相比轮枝镰刀菌。

FOXG_02818基因位于8号染色体，编码全长TOR蛋白（命名为TOR1a），而FOXG_15946位于2b号染色体，编码截短的TOR同源基因（TOR1b），它缺少633个N端氨基酸残基，具有93个蛋白质剩余部分与FOXG_02818的氨基酸同一性百分比。

为了询问TOR是否介导侵入性生长的氮抑制，我们添加了雷帕霉素，这是一种高度特异性的TOR抑制剂，在存在抑制浓度的铵的情况下，雷帕霉素处理可恢复尖孢镰刀菌的玻璃纸渗透。

在测试的不同应激诱导化合物中，只有雷帕霉素和咖啡因在较小程度上被报道为TOR的抑制剂，恢复了玻璃纸对铵的渗透，这表明雷帕霉素的去阻遏作用与TOR失活有关，而不是一般应激反应的结果。

对单个氨基酸的饥饿会触发称为一般氨基酸控制系统的调节途径，这会导致在通常抑制这种反应的铵浓度下激活侵入性生长，我们测试了单个氨基酸的饥饿是否也可以通过添加3-氨基三唑（一种诱导组氨酸饥饿的组氨酸类似物）在存在铵的情况下恢复的玻璃纸渗透。

与雷帕霉素相比，3-氨基三唑并没有超越铵的抑制作用，这表明一般氨基酸控制系统在玻璃纸渗透中没有发挥主要作用，这些结果表明(1)Gln是氮抑制玻璃纸入侵的主要信号，和抑制信号的传递需要保守蛋白激酶TOR。

基因通过赋予对有毒氨基酸类似物和甲基铵的抗性的突变鉴定，导致氮调节基因的去阻遏，MeaB编码一种具有bZIPDNA结合基序的蛋白质，该基序介导构巢曲霉中的氮代谢物抑制。

基因组数据库的BLASTp搜索确定了单个MeaB直系同源物FOXG_02277，我们利用之前的插入诱变筛选，获得的ΔmeaB突变体的可用性来研究该bZIP因子在玻璃纸渗透的氮调控中的作用。

ΔmeaB菌株显示出对硝酸盐或亚硝酸盐等二次氮源的生长减少以及对dl-对-氟苯丙氨酸的抗性以及对有毒硝酸盐类似物氯酸盐的敏感性增加，虽然这些表型与的meaB突变体报告的表型非常相似。

但我们注意到ΔmeaB菌株在铵作为唯一氮源时生长非常差，将来自(FoMeaB)或来自(AnMeaB)的MeaB基因引入ΔmeaB突变体，恢复了所有测试氮源的野生型生长，我们得出结论，MeaB在氮利用中的作用在和之间高度保守。

本研究发现在首选氮源为铵的条件下，多种MAPK激活的毒力功能受到明显抑制，通过使用特定的抑制剂，笔者发现L-甲硫氨酸亚砜亚胺(MSX)和雷帕霉素分别作用于Gln合成酶和蛋白激酶TOR。

且能够消除铵对这些功能的抑制作用，并且这种消除作用依赖于bZIP蛋白MeaB，进一步的实验结果显示，提供铵而非硝酸盐延缓了由维管束枯萎病真菌引起的病症发展。

还揭示了一个保守的氮信号调控通路，该通路通过TOR和MeaB蛋白控制植物病原真菌的感染性生长，铵作为首选氮源能够抑制病原真菌的侵入性生长、营养菌丝融合和宿主粘附等与毒力相关的功能，这个结论拓展了我们对植物病原真菌与宿主之间相互作用的认识，为进一步揭示病原菌致病机制以及病害防治提供了有价值的参考。

参考文献：

顾广杰,崔林开,王树和,李发新,林晓民，《新奥霉素对7种植物病原真菌的室内毒力测定》

周晓罡,姚春馨,丁玉梅,陶南,孙茂林,张绍松，《氮源受限条件下植物病原真菌氮调控基因表达特性》

马养民,赵洁,周雪宁，《植物内生真菌抗植物病原真菌活性物质的研究》